摘 要：目的：通過構(gòu)建體內(nèi)外骨質(zhì)重塑模型，探討Notch信號通路與miRNA-155的相互作用，明確其在難治性鼻竇炎骨質(zhì)重塑中的作用及機(jī)制。方法：選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質(zhì)，檢測Notch的表達(dá)及與骨質(zhì)重塑相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系。檢查制備兔鼻竇炎模型，采用CT掃描及病理切片進(jìn)行骨質(zhì)重塑的評分。HE、堿性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色，從組織學(xué)水平對標(biāo)本骨質(zhì)的炎癥程度進(jìn)行評估，探討不同時(shí)間兔鼻竇炎癥變化程度，通過CT值評估骨質(zhì)重塑的程度。結(jié)果：Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達(dá)，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮一定作用。結(jié)論：Notch信號傳導(dǎo)通路在鼻竇炎模型兔疾病的發(fā)生發(fā)展中，具有重要的調(diào)控作用。 關(guān)鍵詞：鼻竇炎模型兔 Notch 信號通路 慢性鼻竇炎(CRS)是發(fā)生于鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。歐洲的一項(xiàng)多中心研究顯示CRS的患病率為6.9%～27.1%，中國CRS的發(fā)病率為2.2%～8%，且常合并哮喘及慢性阻塞性肺疾病等下呼吸道疾病，已成為嚴(yán)重的公共健康問題[1]。Notch受體于1917年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，于1983年被首次克隆并命名[2]。Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達(dá)，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮一定作用[3]。因此，本項(xiàng)目通過體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞，并觀察與骨質(zhì)重塑密切相關(guān)的多種蛋白和細(xì)胞因子與Notch信號通路的關(guān)系，用mi RNA-155阻斷細(xì)胞Notch信號通路的傳導(dǎo)，觀察蛋白及細(xì)胞因子表達(dá)的變化。 資料與方法 分離、培養(yǎng)兔大腿骨骨髓破骨細(xì)胞，比較細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激前后不同時(shí)相Notch受體表達(dá)與多種蛋白和細(xì)胞因子的關(guān)系。(1)選用新西蘭白兔，斷頸處死，無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。接種于10 cm培養(yǎng)皿，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)(飽和濕度、5%CO2、37℃)12 h后收集非貼壁細(xì)胞，1 500 r/min,37℃離心5 min，棄上清，視為破骨前體細(xì)胞，加入M-CSF(20 ng/m L)和RANKL(30 ng/m L)誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化。HE、堿性磷酸酶和TRAP染色，光鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)。(2)利用RT-PCR、Westernblotting與流式細(xì)胞術(shù)在m RNA與蛋白水平檢測Notch受體在破骨細(xì)胞的表達(dá)。試驗(yàn)組分別加入含不同濃度的LPS的培養(yǎng)液，對照組只加入含5%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液，形態(tài)學(xué)觀察及四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)細(xì)胞計(jì)數(shù)。觀察Notch蛋白表達(dá)量的變化。評估這些變化與破骨細(xì)胞數(shù)量變化的關(guān)系。(3)另選幾組在加入含LPS的培養(yǎng)液同時(shí)，用mi RNA-155阻斷細(xì)胞Notch信號通路的傳導(dǎo)，觀察蛋白及細(xì)胞因子表達(dá)變化和破骨細(xì)胞數(shù)量變化。 制備兔鼻竇炎模型，并評估骨質(zhì)重塑的程度：(1)選擇新西蘭白兔進(jìn)行CT檢查，并建立排除鼻和鼻竇疾病的模型。該細(xì)菌獲自國際標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌菌株，并用作1麥當(dāng)勞單位(108CFU/m L)在正常生理鹽水中的懸浮液。稱重動(dòng)物并通過耳靜脈注射用2.5%戊巴比妥鈉0.8 m L/kg麻醉。在鼻子后面的中線右側(cè)做一個(gè)1～1.5 cm的縱向切口，將皮下組織與骨膜分開。在上頜竇的前壁開一個(gè)直徑為3 mm的孔，取適量的無菌棉球并使用內(nèi)鏡。在直視下，上頜竇并沒有完全被上頜竇的內(nèi)側(cè)所阻塞。使用1 m L注射器，將0.3 m L細(xì)菌懸浮液吸入鼻竇和上頜竇的絨毛，然后逐層縫合骨膜，皮下組織和皮膚，并使用酒精，消毒傷口。(2)到達(dá)實(shí)驗(yàn)周后，進(jìn)行CT掃描以測量每個(gè)顯示上頜竇骨壁的CT圖像中最厚骨骼的CT值，并獲得最大值、最小值和平均值。收集CT數(shù)據(jù)后，筆者記錄了該動(dòng)物死于5種過量的鈉過量。保留鼻頜竇組織的樣本。將樣品在10%中性甲醛中固定3 d，用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣2個(gè)月，包埋在常規(guī)石蠟中，制備連續(xù)切片并用HE染色。每只動(dòng)物隨機(jī)選擇5片上頜竇和上頜竇壁，并在光學(xué)顯微鏡下觀察、評估上頜竇和上頜竇壁的骨質(zhì)量。 選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質(zhì)，檢測Notch受體的表達(dá)，及其與骨質(zhì)重塑相關(guān)多種蛋白和細(xì)胞因子的關(guān)系。選取兔鼻竇炎模型鼻道竇口復(fù)合體骨質(zhì)，利用RT-PCR、Westernblotting與流式細(xì)胞術(shù)檢測Notch受體的表達(dá)。觀察細(xì)胞因子與Notch蛋白的關(guān)系，以及與骨質(zhì)重塑程度的關(guān)系。 mi RNA-155抑制Notch信號通路對兔鼻竇炎模型骨質(zhì)重塑的影響。兔鼻竇炎模型腹腔注射mi R-155抑制Notch信號通路，采用CT掃描及病理切片進(jìn)行骨質(zhì)重塑的評分。HE、堿性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色，從CT值及組織學(xué)水平評估標(biāo)本骨質(zhì)炎癥程度的變化，選取兔鼻竇炎模型鼻竇骨質(zhì)，檢測Notch受體的表達(dá)，進(jìn)而探討mi RNA-155與Notch信號通路的交互作用。 結(jié)果 Notch基因在慢性鼻竇炎小鼠鼻中隔黏膜中高表達(dá)，說明Notch基因在慢性鼻竇炎的炎癥過程中發(fā)揮著一定的作用。詳見圖1。 圖1 小鼠鼻中隔黏膜Notch1-4m RNA的表達(dá)量比較 討論 因?yàn)镹otch受體及其配體包含跨膜區(qū)域，所以Notch信號傳導(dǎo)途徑在相鄰細(xì)胞之間傳遞信息。當(dāng)配體與相鄰細(xì)胞中的受體結(jié)合時(shí)，只有金屬蛋白酶家族的腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶(TACE)被激活，Notch受體的大多數(shù)胞外域(NECD)被TACE阻斷，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被阻止、觸發(fā)。結(jié)構(gòu)域(NICD)中的構(gòu)象變化使其更容易受到γ-分泌酶的作用，并且NICD在第二次切割后釋放。NICD以兩種方式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，從而激活下游靶基因。即c-蛋白結(jié)合因子1(CBF1)依賴性途徑(也稱為經(jīng)典途徑)和CBF1非依賴性途徑(也稱為非經(jīng)典途徑)。CBF1在與NICD結(jié)合之前是一個(gè)轉(zhuǎn)錄阻遏物，可能會抑制Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)NICD進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)，它與CBF1和轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML結(jié)合，將CBF1從轉(zhuǎn)錄阻遏物轉(zhuǎn)化為激活物，形成促進(jìn)Notch靶基因轉(zhuǎn)錄的三元復(fù)合物。最著名的缺口靶基因是編碼基本螺旋-環(huán)-螺旋(b HLH)家族的轉(zhuǎn)錄因子的基因。這些轉(zhuǎn)錄因子可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游分子的表達(dá)。到目前為止，關(guān)于非經(jīng)典途徑的研究很少，并且尚不清楚細(xì)胞如何在這兩種途徑之間進(jìn)行選擇。此外，研究表明，Notch信號通路本身具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。該機(jī)制對于維持Notch信號通路中適當(dāng)?shù)幕钚运胶途S持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。 研究表明，Notch信號通路在鼻竇炎的炎癥過程中起重要作用，不僅影響B(tài)和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育和免疫反應(yīng)，而且影響骨骼重塑的調(diào)節(jié)。Notch信號傳導(dǎo)可通過降低OPG表達(dá)水平以非細(xì)胞自主方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成。體外實(shí)驗(yàn)還表明，Notch1和Notch2信號可以自主調(diào)節(jié)骨疾病細(xì)胞的分化過程。抑制骨病前體的Notch 1信號以促進(jìn)分化為骨病細(xì)胞。用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號或用sh RNA干擾阻斷Notch 2信號可以阻斷由核因子-k B受體激活劑配體誘導(dǎo)的骨病性細(xì)胞分化過程。Notch 2信號的激活可能會促進(jìn)NF-k B。受體活化劑配體誘導(dǎo)的骨分裂和分化過程。因此，在骨疾病的分化過程中，調(diào)節(jié)切口信號的過程涉及兩種細(xì)胞方法(自主或非自主)。由于骨病性前體細(xì)胞主要表達(dá)Notch 2受體，因此表明Notch信號傳導(dǎo)的聯(lián)合作用可能是骨病性細(xì)胞分化的積極調(diào)節(jié)劑。 參考文獻(xiàn) [1]Heng Z,Min T,Pin-Fang K,et al.Effects of irbesartan on Notch1 signaling pathway in diabetic rats with myocardial injury[J].Chinese Journal of Applied Physiology,2018,34(5):427-431. [2]Hsiao CD.Overexpression of Notch Signaling Induces Hyperosteogeny in Zebrafish[J].International Journal of Molecular ences,2019,20(15):3613. [3]Wu TY,Hu HH,Chen C.Effects of ivabradine on Notch and NF-kappa B signaling pathway in myocardial cells of rats with myocardial infarction[J].海南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào):英文版,2019,25(11):9-13. [4]蔡萬翔,江蓉星,王敏,等.活血通絡(luò)湯在家兔激素性股骨頭缺血性壞死模型中對Notch1、DLL3和HERP1的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018(1):300-303. [5]胡敏利,應(yīng)雙偉,羅文達(dá).mi R-92a-3p靶向調(diào)控NOTCH信號通路對T-ALL細(xì)胞增殖的影響機(jī)制[J/OL].重慶醫(yī)學(xué):1-6[2020-12-28]. 本文由期刊論文網(wǎng)首發(fā)，一個(gè)權(quán)威專業(yè)的學(xué)術(shù)論文發(fā)表知識網(wǎng)。 文章名稱：鼻竇炎模型兔的Notch信號通路功能的動(dòng)態(tài)變化