摘 要：目的 了解2017—2018年大連市兩種不同來源的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布差異。方法 對2017—2018年大連市食品和患者兩種來源共160株副溶血性弧菌用VITEK 2 compact全自動微生物鑒定系統進行生化鑒定，并檢測不耐熱溶血素基因（tlh）、耐熱直接溶血素基因（tdh）、耐熱相關溶血素基因（trh）、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系統（T3SS1、T3SS2α、T3SS2β）。結果 160株副溶血性弧菌經系統生化鑒定全部為副溶血性弧菌。兩種來源菌株tlh、T3SS1攜帶率均為100%,trh攜帶率為0，攜帶率無差異；食品來源菌株的毒力基因T3SS2β攜帶率（1.20%）略高于患者來源菌株（0），差異無統計學意義（χ2=0.934,P>0.05）；食品來源菌株的toxRS/new攜帶率（10.84%）明顯高于患者來源菌株（2.60%），差異有統計學意義（χ2=4.242,P<0.05）；食品來源菌株的tdh、orf8、T3SS2α的攜帶率（分別為8.43%、3.61%、19.28%）明顯低于患者來源的菌株（分別為70.13%、25.97%、88.31%），差異均有統計學意義（χ2=64.452、16.224、76.336，均P<0.05）；食品來源菌株tdh-/trh-/orf8-/T3SS2α-/T3SS2β-比例（68.67%）明顯高于患者來源菌株（6.49%），差異有統計學意義（χ2=65.071,P<0.05）；兩種來源的菌株均不存在同時攜帶tdh/toxRS/new的菌株。結論 2017—2018年大連市食品和患者兩種來源的菌株均不存在大流行菌株，都攜帶tlh和T3SS1，不攜帶trh；除toxRS/new外，食品來源的副溶血性弧菌毒力基因攜帶率明顯低于患者來源的菌株。 關鍵詞：大連 副溶血性弧菌毒力基因 副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性弧菌，屬于弧菌科、弧菌屬，存在于近海海水及海產品中。除外傷引起的傷口感染及敗血癥，副溶血性弧菌最常見的是引起急性胃腸炎，其原因通常是人們生食或食用未充分煮熟的海產品。有研究顯示，不同來源的副溶血性弧菌攜帶毒力基因差異較大，大部分環境分離株（包括食品分離株）缺少毒力基因[1]，不能導致實驗動物腹瀉，而臨床分離株則能導致實驗動物腹瀉[2]；不同地區流行的副溶血性弧菌攜帶的毒力基因也有很大差別[3]。我們檢測2017—2018年大連市食品和患者兩種來源的副溶血性弧菌毒力基因，包括不耐熱溶血素基因(tlh)、耐熱直接溶血素基因（tdh）、耐熱相關溶血素基因(trh)、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系統（T3SS1、T3SS2α、T3SS2β），分析兩種來源菌株攜帶毒力基因的差異。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 實驗菌株 收集2017和2018年大連市食品和患者來源的副溶血性弧菌共160株，其中食品來源菌株83株，主要是食品風險監測和食物中毒事件中從食品分離的菌株；患者來源菌株77株，主要是大連市食源性致病菌主動監測和食物中毒事件中從患者糞便分離的菌株。 1.1.2 主要的試劑與培養基 胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptose Soya Agar,TSA）（北京陸橋技術股份有限公司，Lot No.180705),vitek2革蘭氏陰性細菌鑒定卡（法國梅里埃，Lot No.2410915403),Taq酶（日本寶生物，Lot No.RR001A），引物由華大基因合成。 1.1.3 主要的設備 全自動細菌鑒定和藥敏分析系統（法國梅里埃，VITEK2 Compact),PCR儀（美國伯樂，C1000 Touch Thermal cycler），毛細管電泳儀（美國凱杰，Qiaxcel）。 1.2 方法 1.2.1 生化鑒定復核 將待復核菌株接種至含3%氯化鈉TSA,37℃培養24 h，復蘇后用VITEK2 Compact全自動細菌鑒定系統進行生化鑒定。 1.2.2 毒力基因檢測 用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）方法檢測毒力基因：tlh、tdh、trh、toxRS/new、orf8、T3SS1、T3SS2α及T3SS2β。核酸提?。壕陱吞K后，接種于含3%氯化鈉TSA平板，37℃培養24 h后，挑取單個菌落于200μL滅菌水中充分研磨，10 000 r/min、離心半徑13.5 cm、離心5 min，棄去上清液，加入100μL裂解液99℃金屬浴10 min,10 000 r/min離心5 min，上清即為DNA。PCR反應體系25μL,10×PCR緩沖液2.5μL,Taq DNA聚合酶0.25μL，脫氧核糖核酸（dNTP)2μL，引物（10μMol/L）各1μL,DNA模板1μL，加無酶H2O補充至25μL。tlh/tdh/trh按照國家食品安全風險評估中心提供的引物序列進行合成，其他引物按照文獻[1-3]報道序列進行合成。其中T3SS1、T3SS2α和T3SS2β各自有4個目的基因，任何一個目的基因檢測陽性，判斷相應基因陽性。T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694,T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362,T3SS2β包括Be ta＿vscC2/Beta＿vscS2/Beta＿vopB2/Beta＿vopC。tlh/tdh/trh、orf8、T3SS1、T3SS2α反應條件為94℃預變性3min;94℃變性30 s,45℃退火60 s,72℃延伸3 min，共35個循環；72℃延伸5 min。toxRS/new、T3SS2β反應條件為：94℃預變性3 min;94℃變性30 s,60℃退火60 s,72℃延伸3 min，共35個循環；72℃延伸5 min。 1.3 統計學分析 應用SPSS 20.0進行分析，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。 2 結果 2.1 tlh/tdh/trh基因 食品來源的83株和患者來源的77株菌株都檢出tlh基因，檢出率為100%，確認160株細菌都是副溶血性弧菌；沒有菌株檢出trh,trh檢出率為0。tdh基因的檢出率合計為38.13%，食品來源菌株的tdh攜帶率（8.43%）明顯低于患者來源菌株（70.13%），差異有統計學意義（χ2=64.452,P<0.05）。見圖1A和表1。 2.2 orf8基因 orf8基因的總檢出率為14.38%，食品來源菌株的orf8攜帶率（3.61%)明顯低于患者來源菌株（25.97%），差異有統計學意義（χ2=16.224,P<0.05）。見圖1B和表1。 2.3 toxRS/new基因 toxRS/new基因的總檢出率為6.88%，食品來源菌株的toxRS/new攜帶率（10.84%）明顯高于患者來源菌株（2.6%），差異有統計學意義（χ2=4.242,P<0.05）。見圖1C和表1。 2.4 T3SS1基因 T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694，所有菌株都檢出了這4種基因，檢出率為100%。見圖1D和表1。 2.5 T3SS2α基因 T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362，總檢出率為52.50%，食品來源菌株的T3SS2α攜帶率（19.28%)明顯低于患者來源菌株（88.31%），差異有統計學意義（χ2=76.336,P<0.05）。見圖1E和表1。 2.6 T3SS2β基因 T3SS2β包括Beta＿vscC2/Beta＿vscS2/Beta＿vopB2/Beta＿vopC，只有1株菌檢出Beta＿vopC，總檢出率為1.67%，食品來源菌株的毒力基因T3SS2β攜帶率（1.2%）略高于患者來源菌株的攜帶率（0），差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1F和表1。 圖1 2017—2018年大連市兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因毛細管電泳結果 注：M-marker;S—樣本；NTC—陰性對照；PTC—陽性對照。 表1 2017—2018年大連市兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因檢出情況[株（%）] 2.7 合并分析 兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因攜帶情況，食品來源菌株tdh-/trh-/orf8-/toxRS/newT3SS2α-/T3SS2β-的比例（68.67%）明顯高于患者來源菌株（6.49%），差異有統計學意義（χ2=65.071,P<0.05）。兩種來源菌株tlh、T3SS1攜帶率都為100%,trh攜帶率為0。此外，兩種來源菌株都沒有同時檢出tdh和toxRS/new基因。 3 討論 副溶血性弧菌是沿海甚至內陸地區常見的食源性致病菌，但多數菌株不致病，只有少數有毒力的菌株才會致病[1]。副溶血性弧菌由多個毒力因子共同發生作用而導致人體疾病，比較常見的毒力因子包括黏附因子、侵襲因子、溶血毒素、脂多糖、蛋白酶、尿素酶、外膜蛋白及分泌系統等，分別由相應的基因編碼[2]。 tlh是副溶血性弧菌的一種特異性基因，編碼TLH。TLH本身并不具有溶血活性,目前還不明確TLH是否具有致病性。所有的副溶血性弧菌均含有tlh，因此經常用該基因進行副溶血性弧菌鑒定。但是有試驗發現副溶血性弧菌和溶藻弧菌的tlh基因在同源性上可達60%～70%，所以具有tlh基因能否判定為副溶血性弧菌，還需進一步檢測[3]。本次分析中83株食品來源和77株患者來源的菌株均檢出tlh基因，且這些菌株生化鑒定結果都是副溶血性弧菌，所以該160株菌株均為副溶血性弧菌。 tdh和trh分別編碼耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin,TDH）和耐熱相關溶血素（thermostable related hemolysin,TRH）。TDH和TRH被認為是副溶血性弧菌最主要的毒力因子，TDH具有溶血活性、細胞毒性、心臟毒性以及致死性；TRH具有溶血性和腸毒素作用。一般以有tdh和trh基因作為判定副溶血性弧菌是否有致病性的標準[4]。研究顯示,絕大多數的患者來源菌株攜帶tdh基因,少數菌株攜帶trh基因,極少數同時攜帶tdh和trh[5]，而在外環境和食品分離株這2種基因的攜帶率均很低[6]。本次分析中食品來源的菌株tdh攜帶率為8.43%，明顯低于患者來源的菌株（70.13%）；兩種來源的菌株均未檢出trh基因，與文獻[7-9]報告的結果相似。表明食品來源的菌株獨力較弱，而患者來源的菌株毒力較強。但是實驗敲除tdh和trh基因后，菌株還有細胞毒性，腸毒性沒有完全消除只是減弱，說明副溶血性弧菌還有其他的致病因子[10-11]。 1996年后,副溶血性弧菌出現了大流行株（高致病株03∶K6)[12]。是大片段的基因片段轉移形成了新O3∶K6型菌株，如toxRS/new序列、orf8基因（位于f237噬菌體上）[13]。一般認為同時檢出毒力基因tdh和toxRS/new判定為大流行株[14]；僅檢出tdh或trh判定為致病株。本次分析發現食品來源菌株toxRS/new基因攜帶率為10.84%，明顯高于患者來源菌株的檢出率（2.60%）。食品來源的菌株orf8的攜帶率（3.61%）明顯低于患者來源的菌株（25.97%），患者來源的菌株orf8的攜帶率低于文獻[15]報告的檢出率，而且兩種來源的菌株均未同時檢出tdh/toxRS/new,即未檢出大流行株。以上說明大連市兩種來源的副溶血性弧菌均不是大流行株。 Ⅲ型分泌系統（T3SS）是沙門菌、志賀菌、耶爾森菌、副溶血性弧菌等腸道致病菌的重要毒力因子，與其致病性關系緊密。所有副溶血性弧菌都有的Ⅲ型分泌系統稱T3SS1，位于1號染色體上，表達的效應蛋白介導宿主細胞自體吞噬導致細胞死亡，具有細胞毒性。T3SS2與tdh和trh都存在于2號染色體致病島（PAI）上，表達效應蛋白VopA、VopC、VopL和VopT，具有腸毒性。T3SS2又可分為T3SS2α和T3SS2β兩個亞型，文獻研究顯示，T3SS2α存在于tdh+/trh-菌株中，T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株中[16]。文獻研究顯示，環境和臨床分離株均攜帶T3SS1[17-19]，本次分析中兩種來源的所有菌株均攜帶T3SS1基因。食品來源菌株tdh攜帶率為8.43%(7/83),T3S2α攜帶率為19.28%(16/83),tdh/T3S2α攜帶率為8.43%(7/83）；患者來源菌株tdh攜帶率為70.13%(54/77),T3S2α攜帶率為88.31%(68/77),tdh/T3S2α攜帶率為70.13%(54/77）?？梢钥闯鰞煞N來源菌株的T3S2α的攜帶率均高于tdh檢出率，說明有些菌株雖無tdh基因，但是擁有T3S2α基因，即T3S2α也存在于tdh-/trh-菌株中。本次分析中兩種來源的160株細菌未檢出trh基因，只有1株食品來源的菌株檢出T3SS2β，說明T3SS2β也存在于tdh-/trh-菌株中。 食品來源菌株不攜帶tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β的菌株占68.67%(57/83），而患者來源菌株該比例為6.47%(5/77），說明食品來源副溶血性弧菌毒力基因攜帶率低于患者來源的菌株，且患者來源菌株除tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β還可能攜帶其他毒力基因。 本次分析結果表明，2017—2018年大連市兩種來源的菌株均不存在大流行菌株，都攜帶tlh和T3SS1，不攜帶trh；除toxRS/new外，食品來源的副溶血性弧菌毒力基因攜帶率明顯低于患者來源的菌株。 作者聲明 本文無實際或潛在的利益沖突 本文由期刊論文網首發，一個權威專業的學術論文發表知識網。 文章名稱：大連市兩種來源副溶血性弧菌毒力基因的分析