摘 要：目的 研究探討對(duì)于腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行替莫唑胺化療與HOXB9基因以及多重耐藥相關(guān)分子和耐藥分子的相關(guān)表達(dá)情況的相關(guān)性。方法 選取我院在2016年7月至2021年7月所接收和治療的經(jīng)過(guò)化療的腦膠質(zhì)瘤患者共80例，之后按照患者是否對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性分為耐藥組以及非耐藥組，兩組各40例，之后對(duì)比兩組患者的HOXB9基因以及相關(guān)的耐藥因子的具體表達(dá)情況。主要包括：P糖蛋白（P-gP）、O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、人類(lèi)mut-s同系物（hMLH）、人類(lèi)mut-s同系物2(hMSH2)。結(jié)果 經(jīng)過(guò)對(duì)比可知，耐藥組的HOXB9以及P-gP、MGMT的陽(yáng)性率為72.50%、77.50%、80.00%明顯高于非耐藥組的17.50%、20.00%、17.50%（χ2=24.444,P <0.05）,hMLH以及hMSH2的陰性率明顯高于非耐藥組（P <0.05）。經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行耐藥性回歸分析可知，高表達(dá)率HOXB9基因可能是替莫唑胺化療腦膠質(zhì)瘤患者耐藥的一個(gè)因素。結(jié)論 HOXB9基因與多個(gè)P-gp、MGMT、hMLH和hMSH2的分子密切相關(guān)，可能與腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺的耐藥有關(guān)。在治療中可以實(shí)時(shí)檢測(cè)患者的HOXB9的情況，若出現(xiàn)異常及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，可能有助于降低腦膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的耐藥率。
關(guān)鍵詞：替莫唑胺腦膠質(zhì)瘤 HOXB9 耐藥分子 相關(guān)性
膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)迅速，具有較強(qiáng)的侵襲性，手術(shù)治療組織難度系數(shù)大，徹底清除病灶，許多藥物難以進(jìn)入血腦屏障，化療藥物長(zhǎng)期使用后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，因此，即使是手術(shù)結(jié)合放療和化療的患者，也同時(shí)需要有效的治療基礎(chǔ)來(lái)提高化療的整體治療效果[1-2]。治療腦膠質(zhì)瘤的有效藥物包括替莫唑胺，但患者可能因耐藥性原因造成治療效果低下。以往的研究表明，替莫唑胺的耐藥與多藥耐藥蛋白有著緊密的聯(lián)系。多藥耐藥主要表現(xiàn)為多藥耐藥相關(guān)分子的異常表達(dá)，如P-GP、MGMT、DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)等[3-4]。h MLH和h MSH2基因是否穩(wěn)定直接影響細(xì)胞的修復(fù)功能，而HOXB9在乳腺癌、肺癌等多種疾病中表達(dá)不同。在促進(jìn)腫瘤發(fā)展以及凋亡中起重要作用[5-6]。因此，研究HOXB9基因在腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療中的表達(dá)是否具有合成代謝作用，以及HOXB9基因的表達(dá)與替莫唑胺化療耐藥之間是否存在一定的相關(guān)性，具有重要的臨床意義[7-8]。研究選取我院在2016年7月至2021年7月80例患者，觀察腦膠質(zhì)瘤化療患者HOXB9基因表達(dá)與多藥耐藥相關(guān)分子及上述指標(biāo)的關(guān)系。現(xiàn)將具體內(nèi)容報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取我院在2016年7月至2021年7月所接收治療經(jīng)過(guò)化療的腦膠質(zhì)瘤患者共80例，按照患者是否對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性分別分為耐藥組及非耐藥組，兩組各40例。耐藥組中男21例，女19例，年齡在65～75歲，平均年齡（69.11±2.04）歲，非耐藥組中男20例，女20例，年齡在66～77歲，平均年齡（69.14±2.02）歲。兩組一般資料比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。且所有患者及家屬均知曉此次研究。此次研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理會(huì)支持。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)過(guò)磁共振成像確診為腦膠質(zhì)瘤。(2)所有患者術(shù)后均接受化療。(3)所有患者病理組織為完全封閉狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。(2)伴隨其他惡性腫瘤。(3)機(jī)體素質(zhì)低，不能忍受化療。(4)其他臟器功能障礙。
1.2 方法
所有儀器以及試劑：主要使用由中國(guó)科學(xué)院上海研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供的人惡性膠質(zhì)瘤u251株；并且使用由Solarbio（美國(guó)）生產(chǎn)胎牛血清和DMEM，噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒選用碧鹽田生物科技有限公司，Tranawall試驗(yàn)箱由康寧（美國(guó)）制造，從AB-CAM（美國(guó)）中篩選出兔抗HOXB9和抗人Ig G二級(jí)抗體，Prime Script由上海吉馬制藥技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)完成。CDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京康美有限公司提供，用于熒光定量PCR。ENVISIONTM兔和大鼠染色試劑盒、SYBR Premix Extaq TM II試劑盒和抗MGMT、HMSH2與HMLH多克隆抗體分別選自上海基因公司、北京康威之生物技術(shù)有限公司、武漢寶西。樣品處理方法：所有樣品固定、脫水、切片、包埋、染色。以上操作嚴(yán)格按照試劑、儀器、試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，全過(guò)程由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行，嚴(yán)格質(zhì)量控制。
1.3 觀察指標(biāo)
(1)觀察兩組患者的H O X B 9基因、P-g P、MGMT、h MLH以及h MSH2的陽(yáng)性率以及陰性率。其中HOXB9基因判定方法為：選擇5個(gè)視野高功率場(chǎng)（細(xì)胞數(shù)>200）觀察陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的占比。檢測(cè)規(guī)則為：陽(yáng)性染色信號(hào)為核內(nèi)黃棕色顆粒，0為未染色，1為淺黃色，2為黃色，3為棕黃色；然后根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分為0分（陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%）、1分（≥5%和<25%）、2分（≥25%和<50%）、3分（≥50%和<75%）和4分（≥75%）。相乘得最后分?jǐn)?shù)，并根據(jù)最終分?jǐn)?shù)計(jì)算著色程度。p-gp和mgmt檢測(cè)方法分為陽(yáng)性（膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)棕色顆粒10%～30%）、強(qiáng)陽(yáng)性（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥30%）和陰性（陽(yáng)性細(xì)胞少于10%）。HMLH和HMSH2通過(guò)隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野區(qū)的400個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)測(cè)定的。陽(yáng)性：腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥25%；陰性：陽(yáng)性細(xì)胞少于25%。在上述檢測(cè)結(jié)果中，以陽(yáng)性切片為對(duì)照，5%胎牛血清替代原代抗體為陰性對(duì)照。本研究以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性均為陽(yáng)性。(2)使用回歸分析HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮浴?br />
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
使用SPSS20.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)與Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá)
經(jīng)過(guò)對(duì)比兩患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá)可知，耐藥組的HOXB9以及P-g P、MGMT的陽(yáng)性率明顯高于非耐藥組（P<0.05),h MLH以及h MSH2的陰性率明顯高于非耐藥組（P<0.05）。見(jiàn)表1。
表1 兩組患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá)比較[n(%)]
2.2 HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮曰貧w分析
經(jīng)過(guò)分析HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮钥芍越邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮詾橐蜃兞浚訦OXB9基因?yàn)樽宰兞浚?jīng)Logistic回歸分析證實(shí)HOXB9可能是影響患者耐藥的影響因素（P<0.05）。見(jiàn)表2。
表2 HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊熁颊叩哪退幮曰貧w分析
3 討論
膠質(zhì)瘤抗性機(jī)制是復(fù)雜的、多層次的。盡管對(duì)耐藥基因及其產(chǎn)物進(jìn)行了許多臨床研究，但在接受化療的患者中，耐藥基因與其耐藥性之間的聯(lián)系尚不清楚。研究腦膠質(zhì)瘤患者的耐藥性對(duì)于降低其耐藥性和提高臨床化療效果至關(guān)重要[9-13]。研究表明，腦膠質(zhì)瘤患者化療耐藥是多種因素綜合作用的結(jié)果。膠質(zhì)瘤患者化療耐藥的原因主要包括：(1)化療對(duì)跨越屏障沒(méi)有幫助。(2)少量膠質(zhì)瘤藥物積累。(3)加速許多化療藥物的解毒和代謝。(4)DNA損傷和修復(fù)的影響等。近年來(lái)，腦腫瘤化療的臨床研究進(jìn)一步發(fā)展，HOXB9基因及多藥耐藥相關(guān)分子P-g P、MGMT、HM-LH、h MSH2等的表達(dá)產(chǎn)物與腦膠質(zhì)瘤患者化療耐藥密切相關(guān)[14-17]。替莫唑胺含有大量咪唑嗪環(huán)，為首要化療藥物。它容易進(jìn)入血腦屏障，引起細(xì)胞DNA烷基化，進(jìn)而發(fā)揮毒性作用。其雖在一定程度上改善了患者預(yù)后，但療效較差，尤其對(duì)復(fù)發(fā)患者，主要原因是患者對(duì)替莫唑胺的耐藥增加。因此，探索一種有效逆轉(zhuǎn)耐藥的方法，對(duì)于提高該病患者的化療療效具有重要意義。
HOXB9基因?qū)儆贖OX家族。研究表明HOX家族成員在參與胚胎生長(zhǎng)、干細(xì)胞自我修復(fù)和再生以及組織重建等生理過(guò)程的同時(shí)，還與許多外來(lái)生物的生長(zhǎng)和進(jìn)化密切相關(guān)。此外，它們可以編碼轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)它們之間的共同基因表達(dá)[18-20]。龍璐璐等[21]研究人員研究發(fā)現(xiàn)HOXB9基因是一種抑癌基因，HOXB9基因在甲狀腺乳頭癌的增殖中發(fā)揮著重要作用，可以成為治療的新目標(biāo)。這些結(jié)果表明HOXB9基因可能為治療提供新的思路。
MGMT是DNA修復(fù)酶，可以幫助染色體避免化學(xué)物質(zhì)造成的損傷，這些物質(zhì)有助于治療藥物的細(xì)胞解毒。P-g P分布在細(xì)胞膜上具有分泌和分泌功能，其主要生理功能包括維持正常生理、激素和轉(zhuǎn)化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。吞咽、呼吸代謝和藥物解毒[22-24]。依賴能源的藥物出口泵不僅在抗腫瘤藥物的匯合點(diǎn)，而且在抗腫瘤藥物的交配點(diǎn)。因此一旦P-g P和抗腫瘤藥物結(jié)合起來(lái)，就可以通過(guò)ATP裝置產(chǎn)生能量，ATP裝置將致癌灶細(xì)胞泵出，并減少細(xì)胞中濃度改變，降低藥物作用，產(chǎn)生一定的耐藥性。其中h MLH和h MSH2是主要基因，對(duì)控制基因改變和保持功能的完整性十分重要。錯(cuò)誤修復(fù)系統(tǒng)中的任何基因變化都可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失，使其錯(cuò)誤復(fù)制或不穩(wěn)定[25-27]。本研究結(jié)果提示HOXB9基因的表達(dá)可能與腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺化療產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。HOXB9基因的高陽(yáng)性表達(dá)率可能是腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺化療耐藥的一個(gè)影響因素。且該結(jié)果與Bai等[28]研究結(jié)果中HOXB9基因陽(yáng)性率具有一致性。因此該病患者在應(yīng)用替莫唑胺治療前，可以及時(shí)、合理地干預(yù)HOXB9基因的非正常表達(dá)，以降低其對(duì)治療的抵抗力。然而本研究中的樣本很少，其結(jié)論缺乏臨床證據(jù)證明。因此本項(xiàng)研究的可信度需要通過(guò)今后的進(jìn)一步相關(guān)研究加以驗(yàn)證，以指導(dǎo)臨床患者的化療。
綜上所述，HOXB9基因與MGMT、P-g P、h MSH2和h MLH密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤患者采用替莫唑胺化療后耐藥的危險(xiǎn)因素。建議在進(jìn)行替莫唑胺化療前，可對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行HOXB9基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，對(duì)于表達(dá)非正常的患者，及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，有利于降低接受替莫唑胺化療的腦膠質(zhì)瘤患者的耐藥率。
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文章名稱：替莫唑胺治療腦膠質(zhì)瘤患者HOXB9基因、多重耐藥相關(guān)分子的表達(dá)與相關(guān)性
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