【摘要】目的：探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）提取的多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞（Muse細(xì)胞）對神經(jīng)炎癥微環(huán)境的抑制作用。方法：用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)后，收集hBMSCs細(xì)胞與Muse細(xì)胞上清液（CM）培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，分為對照組、LPS組、BMSC-CM組、Muse-CM組。采用實時熒光定量PCR的方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平。結(jié)果：Muse細(xì)胞上清液培養(yǎng)的炎癥預(yù)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而抗炎標(biāo)記物Arg-1的表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：Muse細(xì)胞可以在一定程度上抑制神經(jīng)炎癥微環(huán)境，促使小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)變，對神經(jīng)炎癥性疾病有應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Muse細(xì)胞 神經(jīng)炎癥 抑制作用
在一些神經(jīng)退行性疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞由于過度活化會釋放促炎因子，通過級聯(lián)反應(yīng)使神經(jīng)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而進(jìn)一步損傷神經(jīng)系統(tǒng)。因此，目前許多研究致力于促使炎癥環(huán)境中的小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變［1］，從而降低炎癥微環(huán)境中促炎因子的表達(dá)，增加抑炎因子含量，緩解炎癥損傷程度。
干細(xì)胞可以在神經(jīng)系統(tǒng)中起神經(jīng)保護(hù)作用，且在多系統(tǒng)中都具有一定的抗炎能力。多系分化持續(xù)應(yīng)激細(xì)胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse cell）可以從脂肪細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等多種細(xì)胞中提取，是一種新型耐受性干細(xì)胞，目前多應(yīng)用于細(xì)胞移植相關(guān)的疾病中，尤其是具有在組織修復(fù)過程中能大量分化為周圍組織細(xì)胞的特點［2］，為修復(fù)提供種子細(xì)胞。
目前，Muse細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的抗炎作用仍鮮有報道，故本研究通過Muse細(xì)胞上清液與炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，探索其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的抗炎效果，評估其在神經(jīng)炎癥治療中的可行性，為神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病提供新的種子細(xì)胞。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系HAPI（ 深圳市豪地華拓生物科技有限公司）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；澳洲胎牛血清（美國Gibco公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；RNA快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA擴(kuò)增試劑盒（日本Takara公司）；大鼠抗人SSEA-3抗體（美國Abcam公司）；羊抗大鼠Alexa Fluor® 647二抗（美國Abcam公司）。
1.2 Muse細(xì)胞的獲取與鑒定
從人骨髓血中分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至第4代時，吸取上清液，加入胰酶進(jìn)行細(xì)胞耐受8 h實驗以獲取Muse細(xì)胞。將Muse細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于polyHEMA包被處理的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。5～6 d后取出單個Muse細(xì)胞球，采用免疫熒光的方法檢測多能干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-3表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況并拍照。
1.3 獲取hBMSCs與Muse細(xì)胞培養(yǎng)上清液當(dāng)hBMSCs與Muse細(xì)胞長至70%后，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)48 h，用15 mL無菌離心管收集培養(yǎng)上清液并離心（10 min，400 g），棄去沉淀，保存于-20℃冰箱中待用。
1.4 實時熒光定量 PCR 檢測腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和Arg-1 mRNA收集12孔板中的HAPI細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測后，確保OD值為2.0左右，剔除不純的細(xì)胞RNA后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，并將cDNA置于-20℃保存。使用實時熒光定量PCR試劑盒，按預(yù)變性95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s循環(huán)40次，重復(fù)3次。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 Muse細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定
Muse細(xì)胞從hBMSCs中分離后，貼壁培養(yǎng)2 d，可見細(xì)胞胞體較hBMSCs細(xì)胞更小，但也呈現(xiàn)纖維細(xì)胞狀，胞體透亮（圖1 A）。Muse細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)皿中經(jīng)過5 d培養(yǎng)可以成球，經(jīng)免疫熒光鑒定，其存在多能干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-3（圖1 B）。
圖1 Muse細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定
A：P1代Muse細(xì)胞形態(tài)（×20）；B：免疫熒光檢測Muse細(xì)胞表面標(biāo)記物
2.2 Muse細(xì)胞上清液對炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影響
實時熒光定量PCR法檢測HAPI小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。100 ng/mL LPS刺激HAPI 6 h后洗去上清液，再將用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的LPS組與對照組相比，TNF-α、IL-1β的mRNA水平顯著增加（P＜0.01），Arg-1的mRNA水平明顯降低（P＜0.01）；與LPS組相比，洗去LPS刺激液后選用干細(xì)胞上清液培養(yǎng)的HAPI細(xì)胞TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但BMSCCM組與Muse-CM組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與此同時，BMSC-CM組、Muse-CM組與LPS組比較，Arg-1的mRNA表達(dá)顯著升高，組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且Muse-CM組較BMSC-CM組的Arg-1表達(dá)水平也有顯著性增加，組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。
表1 Muse細(xì)胞上清液對炎癥性小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-1β和Arg-1 mRNA水平的影響
組別 n TNF-α mRNA IL-1β mRNA Arg-1 mRNA
對照組 3 0.80±0.19 1.04±0.18 1.06±0.12
LPS組 3 10.94±1.04① 4.23±0.29① 0.16±0.15①
BMSC-CM組 3 7.25±0.54② 2.54±0.45② 0.34±0.07②
Muse-CM組 3 6.50±1.05② 2.39±0.40② 0.52±0.76②③
注：與對照組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05；與BMSC-CM組比較，③P＜0.05。
3 討論
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)炎癥是神經(jīng)免疫學(xué)研究的重要課題。神經(jīng)免疫細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活進(jìn)入促炎狀態(tài)已被認(rèn)為是幾種神經(jīng)退行性疾病中重要的病理特征。
小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的單核吞噬細(xì)胞。它們是急性和慢性疾病的中樞性炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞［3］。小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后會差異表達(dá)各種與促進(jìn)或抑制炎癥過程有關(guān)的受體，本研究選用小膠質(zhì)細(xì)胞常見的促炎因子TNF-α、IL-1β以及抗炎因子Arg-1作為研究對象，以探究Muse細(xì)胞對炎癥環(huán)境中的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)水平的作用。本次實驗表明，hBMSCs細(xì)胞與Muse細(xì)胞對這兩種促炎因子的合成都具有良好的抑制效果。Arg-1作為抗炎小膠質(zhì)細(xì)胞的重要表型，其合成水平在炎癥環(huán)境中被顯著抑制了。本次實驗發(fā)現(xiàn)，Muse細(xì)胞較hBMSCs細(xì)胞來說，其提升炎癥環(huán)境小膠質(zhì)細(xì)胞的Arg-1合成能力更強(qiáng)。
綜上所述，Muse細(xì)胞與hBMSCs細(xì)胞類似，可以抑制炎癥環(huán)境中小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，并且可以更大程度上誘導(dǎo)炎癥預(yù)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)變，但其內(nèi)在的免疫作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。
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文章名稱：學(xué)齡期兒童慢性腎臟病心理行為問題現(xiàn)狀調(diào)查分析及PFCC干預(yù)效果的研究
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