關鍵詞:毛細管電泳
隨著生物化學與分子生物學及生物醫學研究的日益深入，研究人員對與生命現象有關的分子的分離分析技術提出了愈來愈高的要求。本文就近年來發展的毛細管電泳及其在生命科學中的應用作些介紹。
1.毛細管電泳儀簡介
毛細管電泳儀商品雖然外型各異，但不外乎由下列幾個部分構成:1.毛細管;2.高壓電源;3.電極及電極液;4.在線檢測器;5.恒溫裝置;6.樣品盤;7.數據收集和處理系統(記錄儀、積分儀、電腦)。
毛細管是由熔融石英加工制得，為克服石英極脆易斷的缺點，在其外壁涂抹了一層聚亞胺酷以增加毛細管的柔性。檢測器位于距樣品盤約毛細管總長的三分之二至五分之四處，對毛細管壁內部分進行光學聚焦。在線檢測器有紫外、熒光和激光等多種檢測方式，目前較為常見的是紫外檢測。此外，將毛細管電泳儀和質譜儀聯用也已見報道。
毛細管中充滿具有一定離子強度的緩沖液后，在其兩端加上高電壓，被分析物除受電場力的作用外，還受電滲流作用。毛細管內壁的石英分子在一般水性環境中(pH2.0以上)因HZSIO3分子的解離，其表面形成一層負電荷，吸引緩沖液中的正離子，這一層正離子在電場的作用下趨向陰極，從而帶動毛細管內整個溶液向陰極移動。此電滲現象在毛細管電泳中起著舉足輕重的作用。雖然被分離的混合物中各分子在特定的電泳緩沖液中帶有不同的凈電荷，但在電滲作用下均向陰極方向泳動。其最終的遷移力由電滲、緩沖液條件及分子本身的泳動力決定。其中泳動力和分子的荷質比有關。
內壁石英分子除能造成電滲流外，還具有吸附溶質中帶正電荷分子的能力，從而會影響分離效果。為避免分析物被管壁吸附，可選用緩沖液的pH大于樣品混合物中蛋白質和多膚的等電點，此時被分析物與管壁帶同種電荷;或者選用pH接近pHZ.o，此時毛細管內壁無解離的負電荷，但此酸性環境易造成蛋白質變性失活，一般僅用于多膚分析。也可對毛細管內壁進行涂層，如中性共價涂層以消除電滲，或采用改變內壁電荷的極性的可逆涂層方法，適于等電點偏高的蛋白質的分離分析。
與平板凝膠電泳手工上樣方式不同，毛細管電泳采用兩種自動進樣方式:流體靜力進樣(通過壓力推動或真空吸入)和電動進樣。每次進樣量為幾納升，一般僅可用于分析鑒定。如要收集分離產物并進行進一步研究，則需重復多次分析以富集分離到的產物。1992年Huang和Mathies等報道毛細管束電泳的實驗結果，數十乃至上百根毛細管平行排列，分離得到的產品產量能提高二個數量級。
2.毛細管電泳的幾種分離模式
毛細管電泳根據分離機理等不同，類似于液相色譜的歸類，分成幾種分離模式，主要為以下幾種:
2.1.自由溶液毛細管電泳(FSCE)或稱
毛細管區帶電泳(CZE)毛細管中只充有電泳緩沖液，根據被分析物的荷質比差異進行分離。應用最廣泛、已見報道的例子有多膚、蛋白質和核酸等生物大分子的分離以及無機離子、氨基酸、藥類等小分子的分析。
2.2.毛細管等電聚燕(CIEF)根據蛋
白質和多膚的等電點進行分離。需選用內壁中性共價涂層的毛細管，陽極端至檢測器有效分離部分(離檢測窗口差幾厘米)充滿兩性電解質溶液，樣品溶液夾在其中以避免直接接觸陽極液(H3P04)。毛細管其余部分(檢測器至陰極)為陰極液(NaOH溶液)。毛細管兩端分別插入陽極和陰極液中，其中毛細管中的溶液和H3PO‘溶液中均含一定濃度的可溶性甲基纖維素作為支持介質。兩性電解質載體和樣品在電場中聚焦至電流趨于零，通過壓力或在正負極加鹽等方式，不同等電點的樣品逐一經過檢測窗口。此方法除了能測定蛋白質和多膚的等電點外，還可鑒定蛋白質的純度及分析不同變異體。毛細管等電聚焦具有比凝膠等電聚焦更高的分辨力，即使選用廣范圍的兩性電解質(PH3~10)，也可分辨相差一個凈電荷的天然蛋白質和其突變體。由于是直接在線檢測，可分析多膚的等電點，而在傳統凝膠等電聚焦中的固定、染色、脫色等步驟中小分子多膚易丟失。整個分析過程可自動化，通常僅需45分鐘左右。
2.3毛細管凝膠電泳(CGE)根據被分
析物的荷質比分離，當凝膠中含有SDS等去垢劑時，則根據它們的分子大小進行分離。主要用于蛋白質、部分多膚和DNA分離。毛細管內的分離介質可以如平板電泳一樣呈凝膠狀，也可以是甲基纖維素溶液，后者便于清洗，可實現毛細管一管多用。溶液中的甲基纖維素分子在電子顯微鏡中呈現纏繞狀，其作用機理類似于凝膠的篩網作用。
2.4.微團電動毛細管色譜(MECC)
在電泳緩沖液中加人一定濃度的去垢劑，如SDS及其類似物，這些分子一端為親水基團，其余部分為疏水結構，在溶液中聚集成一個個微團，稱為假固相，被分析的樣品根據其在假固相和溶液相中的分配進行分離。此方式主要用于小分子(如氨基酸等)和多膚的分離。
3.毛細管電泳在生命科學中的應用
3.1.在多膚研究中的應用
毛細管電泳可以分辨多膚的細微結構差異，如C一端的酞胺化與去酞胺化，單個氨基酸殘基的替換，氨基酸組成相同而序列不同的多膚也能區別開，甚至表面電荷不同而一級結構相同的多膚也有可能分離開。另外用FSCE有時能幫助確定多膚內是否存在二硫鍵。
3.2.在蛋白質研究中的應用
毛細管電泳采用溫和非變性條件，有利于分析蛋白質的細微結構差異并鑒定蛋白質的純度。例如核糖核酸酶A、Bl和BZ一級結構相同，差別在于第34位天冬酞胺殘基上糖基化程度不同。選擇一定的電泳條件可將這三種異構體分開。已知不少遺傳工程重組蛋白需含有與其天然蛋白一樣的特定多糖，毛細管電泳可監控它們所結合多糖的均一性。毛細管電泳最近被用來研究細胞色素C的結構與功能。Albin等報道了用毛細管電泳研究其表面修飾的位點。他們監測了修飾反應過程，比較了修飾前后的胰蛋白酶酶解膚譜，并收集了含有被修飾殘基的膚段，測定其序列，確定了修飾試劑釘復合物所結合的殘基。
由于毛細管電泳分析快速，可用來監測蛋白質化學反應的動力學過程。如分析RNase蛋白酶解產物中含糖膚段去糖昔化的動力學過程。我們實驗室建立了用毛細管電泳測定蛋白激酶A活性的方法，其靈敏度、精確性和線性范圍均不亞于經典的同位素法。
除了自由溶液毛細管電泳外，毛細管等電聚焦和毛細管凝膠電泳在蛋白質研究方的應用例子也很多。Chen等報道了應用毛細管等電聚焦測定RNase幾種變異體的等電點，它們都接近pH梯度的極端值，如RNaseA，Pl9.5;RNaseBa，pl9.0;RNaseTl，pl3.0，以往用凝膠IEF較難測準。圖1為我們實驗室應用CIEF測定重組人表皮生長因子(rhEGF)的等電點，經分析其pl為5.0。
應用毛細管SDS凝膠電泳可以比較方便地分析糖蛋白的分子量。由于多糖基團不結合SDS，糖蛋白的荷質比相對于同樣大小的蛋白質低，用經典的SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳估計的分子量偏大，通常必須在不同濃度的凝膠上進行分析，得到糖蛋白遷移率對數值相對于凝膠濃度的線性關系圖(Ferguson圖)，該直線的斜率稱為此蛋白的排
組系數Kr。Kr和蛋白質的半徑的平方成正比，而蛋白質半徑與其分子量的對數成線性，因此得到標準蛋白分子量的fog值相對于Kr平方根的線性關系圖，測得糖蛋白的Kr值即可推測其分子量。運用傳統的平板凝膠電泳需多次灌膠多次電泳，而毛細管凝膠電泳應用溶液狀的分離介質只需對濃的含甲基纖維素的分離溶液進行一系列的稀釋，按照設定的程序自動分析即可得到Ferguson圖。
3.3在核酸研究中的應用
核酸分離主要是將不同大小片段分開，由于含有不同個數堿基對的DNA分子(即長度不同)其荷質比相同，因而用自由溶液毛細管電泳不能將它們分離。應用毛細管凝膠電泳模式可解決這一問題。目前作為核酸分離介質的分子篩填充料有兩種:一種如同平板凝膠，呈共價交聯固定狀;另一種為可流動的、無交聯的多聚物(如聚丙烯酞胺或甲基纖維素的衍生物)。
應用第一種填料，可進行快速、高分辨力、有效、靈敏的DNA序列測定。Smith等在1990年報道了用毛細管電泳進行快速DNA測序的方法。它們在目前商品化的DNA序列儀的基礎上進行改建，用灌注凝膠的毛細管代替平板凝膠，改進了光學部分，可同時檢測四種波長的熒光，光束聚焦在毛細管5即m內徑上。四種反應產物混合在一起上樣至聚丙烯酸胺變性凝膠;通過測定不同熒光基團標記的DNA片段，通過檢測窗口的次序決定DNA序列。平板凝膠電泳每天可分析lokb，毛細管凝膠電泳可達600kb，分析速度快了數十倍。
用甲基纖維素衍生物作為分離介質適用于分離單堿基差異的DNA片段，因而可分析引物的純度(用于DNA測序、擴增或點突變)，以及鑒定分離基因的探針和用于克隆的連接片段。應用嗅乙錠染料結合紫外檢測或熒光染料花青素結合激光誘導的熒光檢測，靈敏度可提高上千倍(nx10mol.，一5fg)，因而可以診斷遺傳疾病，分析特殊染色體的基因譜圖乃至法醫學鑒定。但這一方法用來分離含幾千以上堿基的DNA片段尚有困難。
3.4.用于其它分子分析
應用毛細管凝膠電泳結合激光誘導熒光檢測分離經熒光標記的多聚糖混合物，具有較高的分辨力，可分離多聚半乳糖醛酸部分水解產生的含不同個數單糖的一系列聚合物。
應用MECC可進行興奮劑分析，在一次電泳中能將以下幾種興奮劑分離:苯丙醇胺、麻黃堿、安非他命、Mephentermine、可卡因、脫氧麻黃堿。1994年美國世界杯足球賽中著名球星馬拉多納被查出服用的興奮劑即為麻黃堿及其類似物。感冒藥康泰克中則含有苯丙醇胺。
4.前景
毛細管電泳今后發展的方向仍是提高分辨力和速度，以滿足生命科學研究日新月異發展的要求，另外將它與質譜儀更好地結合，可對生物分子特性作出更快、更準的分析，并能拓寬毛細管電泳的應用領域
生命科學畢業生論文【二】
[摘要] 目的 了解大鼠對于人胎盤間充質干細胞是否存在天然免疫耐受，分析人胎盤間充質干細胞在大鼠體內出現免疫排斥的可能。 方法 分離提取并鑒定人胎盤間充質干細胞，觀察大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后有無出現相關的免疫排斥癥狀、細胞在大鼠體內的分布情況及臟器的病理改變。 結果 大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后未出現急慢性免疫排斥反應，肝、腎、肺可見標記后的人胎盤間充質干細胞的分布，但相關病理切片未見明顯的淋巴細胞浸潤和纖維組織增生現象。 結論 人胎盤間充質干細胞與大鼠臟器間存在天然的免疫耐受。
[關鍵詞] 胎盤; 間充質干細胞;免疫排斥
近年來，由于間充質干細胞的研究(Mesenchymal stem cells，MSCs)逐步深入，人們對間充質干細胞移植治療大面積骨缺損[1-2]、神經系統損傷[3]、卵巢早衰[4]等疾病產生了濃厚的興趣，而在種類眾多的間充質干細胞中，人胎盤來源的間充質干細胞被認為是免疫原性最低的干細胞之一[5-6]，也是目前研究的熱點之一，學者們多通過大鼠移植人胎盤間充質干細胞來進行相關疾病的研究[7-10]。然而，對于人胎盤間充質干細胞是否在人鼠間中存在天然的免疫耐受，尚無相關的動物實驗基礎。因此，為了了解人胎盤間充質干細胞移植對大鼠各臟器功能的影響，客觀的分析人胎盤間充質干細胞在大鼠體內出現免疫排斥的可能，避免由于免疫的因素掩蓋或降低甚至誤導了研究因素的作用，我們對正常大鼠卵巢尾靜脈注射移植人胎盤間充質干細胞做了一個初步的研究。
1 材料與方法
1.1主要試劑
DMEM-F12培養基(hyclone)、胰酶(hyclone)、胎牛血清(hyclone)、CO2培養箱(日本三洋)、流式細胞儀(FACSCALIBUR)，PKH26試劑盒(sigma)(089K0781)。
1.2 方法
取足月剖宮產分娩的健康胎兒的胎盤，在無菌條件下剪取小塊蛻膜側胎盤組織，進行人胎盤間充質干細胞的原代培養。取第2代的胎盤間充質干細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，采用流式細胞儀進行胎盤間充質干細胞免疫表型分析。PKH26標記胎盤間充質干細胞，按sigma公司的說明書進行操作。實驗分兩組，每組10只大鼠，為wista近交系大鼠，體重180～200 g。第一組為對照組，不做任何處理;第二組為尾靜脈注射組。移植成功后觀察在大鼠體內的分布狀況和大鼠一般情況的觀察，評估PKH26標記的胎盤間充質干細胞在大鼠體內移植的安全性和可行性。
2 結果
2.1胎盤間充質干細胞的形態觀察及生長情況
分離出的胎盤間充質干細胞貼壁生長，細胞呈長梭形，類似于成纖維細胞樣，見胞漿突起，胞漿豐富，核大，呈平行排列或旋渦狀生長，細胞增殖活躍，約3～4 d 即可鋪滿全層，可穩定傳代。見圖1。
2.2 胎盤間充質干細胞免疫表型分析
取第2代細胞進行流式細胞儀檢測，結果發現胎盤間充質干細胞表達 CD29，CD44，CD73，CD90、CD105;不表達CD14，CD34(造血干細胞抗原)，CD45(白細胞共同抗原)、CD106、CD133和HLA-DR(MHC-II)，提示所得貼壁細胞為人間充質干細胞， 表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞、內皮細胞特異性抗原。見圖2。
2.3 胎盤間充質干細胞標記結果
細胞標記后染料在細胞膜上分布均勻一致，在倒置熒光顯微鏡下呈紅色熒光，細胞輪廓清晰。標記百分率為100%。臺盼藍染色細胞的存活率為99%。見圖3。
2.4 大鼠移植胎盤間充質干細胞情況
移植組大鼠進食、活動、大小便均與對照組無異，未發現大鼠出現嗜睡、嘔吐、抽搐、猝死、無尿、精神狀態異常及偏癱等有關器官栓塞的癥狀，亦未發現大鼠出現呼吸困難、出血、脫毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反應。
2.5大鼠體內的胎盤間充質干細胞的分布
熒光顯微鏡下可見PKH26標記后呈紅色熒光的胎盤間充質干細胞，均勻分布在肺臟、肝臟及腎臟皮質。肝臟組織可見均勻分布紅色熒光，整個肝臟結構組織清晰可見，包括肝臟的膽管和肝臟大血管均可見;在腎臟中亦可見紅色熒光細胞主要分布在腎臟皮質，部分腎小體輪廓清晰可見。見圖4。
2.6 大鼠相關臟器的病理切片
移植組大鼠肝、腎、大腦、膀胱HE染色后未見明顯淋巴細胞浸潤和組織結構的破壞，與正常組大鼠未見明顯區別。見圖5。
3 討論
間充質干細胞具有多向分化潛能，在體外特定的誘導條件下能向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、骨髓基質甚至肝臟細胞和神經細胞等分化，是目前細胞治療、基因治療中理想的種子細胞，在神經系統損傷、卵巢早衰、糖尿病、骨缺損等疾病的治療中具有極大的應用前景。而在眾多種類的間充質干細胞中，尤其以胎盤來源的間充質干細胞優點突出，如來源豐富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性較低，無致瘤性和倫理限制等成為目前研究的熱點。
然而，國內外學者對于間充質干細胞治療相關疾病的機制研究，多采用動物模型進行實驗，雖尚未見急慢性免疫排斥的報道，但并不代表著大鼠對于人胎盤來源的間充質干細胞存在天然的免疫耐受，因為實驗中的大鼠多為相關疾病的模型，非正常狀態下大鼠。鐘志年等[11]選擇胎盤間充質干細胞，測定其細胞周期及凋亡率情況，原子力顯微鏡觀察細胞的表面結構，及向成骨細胞誘導分化，探討胎盤間充質干細胞生物學特性和超微結構，并評價其在骨組織工程學中修復重建的應用前景，結果表明人胎盤間充質干細胞為成纖維細胞樣，增殖能力強，9.7%的細胞處于G2/M期或者S期，微結構分析顯示其細胞代謝活躍，黏附能力強，能被誘導分化為成骨細胞，結論認為人胎盤間充質干細胞具備適合應用于骨組織工程學的良好生物學特性，并避免了免疫排斥和倫理問題，可望成為骨組織修復重建中的一個新的治療途徑。本次研究我們選擇了正常的成年大鼠，移植前后均未用任何藥物進行免疫干預。
事實上，人間充質干細胞用于實驗動物研究的結果不令人滿意，所以近年來有學者使用大鼠胎盤來源的間充質干細胞用于動物實驗研究。劉志鵬等[12]通過膠原酶消化法從大鼠胎盤分離并得到間充質干細胞，并建立從大鼠胎盤分離間充質干細胞的方法，觀察其基本生物學特性，結果表明，原代細胞培養8 h后細胞貼壁，24 h內細胞形成集落，第4代細胞大小、形態基本一致，以梭形為主，細胞周期檢測提示G0/G1期、S期、G2期的比例分別為83.76%，8.01%，8.23%，免疫表型分析其表達CD29和CD90，不表達CD45，結論認為胎盤間充質干細胞具有成脂和成骨分化的潛能。
本研究結果也顯示大鼠尾靜脈移植人胎盤間充質干細胞后1個月，大鼠肺、肝、腎等組織均可見標記了PKH26的人胎盤間充質干細胞的分布，說明移植的人胎盤間充質干細胞在大鼠體內可成功存活。病理切片也顯示腦、肝、腎、膀胱等臟器未見明顯的淋巴細胞浸潤和纖維組織增生現象，說明人胎盤間充質干細胞的移植未對大鼠相關臟器產生免疫排斥影響。整個觀察期間大鼠均無明顯的急慢性的免疫排斥反應，如呼吸困難、出血、脫毛、血尿、血便等，以上結果均證明大鼠對人胎盤來源的間充質干細胞存在天然的免疫耐受。
這種免疫耐受有可能源于胎盤間充質干細胞的低免疫原性甚至是無免疫原性。原因可能與以下因素有關：①胎盤在母兒體內起著重要的免疫屏障和激素分泌的作用[13]，所以胎盤來源的間充質干細胞從理論上講免疫原性更低，甚至不排除無免疫原性的可能，并且其分泌的免疫調節活性因子，對免疫功能排斥具有調節作用。②人胎盤間充質干細胞的HLA-DR表面標記陰性。HLA又稱移植抗原，能啟動免疫應答，參與T細胞的分化，誘導免疫應答，胎盤間充質干細胞的HLA-DR表面標記陰性提示了其低免疫原性的部分原因。因此，人胎盤間充質干細胞在研究相關疾病的動物模型中，即便是人-鼠間的異種間移植，但由于存在天然的免疫耐受，對實驗研究的結果影響甚小。
