摘要：研究了5mg/mL黑魚魚皮膠原溶液的流變和熱穩(wěn)定性，并與相同濃度牛皮膠原溶液作比較;考察了溫度對(duì)黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性與成纖維過(guò)程的影響;對(duì)比分析了戊二醛和己二酸-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯用于交聯(lián)改性黑魚膠原溶液的效果。結(jié)果表明，相同濃度的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變學(xué)參數(shù)和熱穩(wěn)定性存在顯著差別，黑魚膠原的分子纏結(jié)程度較低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差;黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性與成纖維行為都具有明顯的溫度依賴性;己二酸NHS酯對(duì)黑魚膠原溶液具有較好的交聯(lián)改性效果，有望取代戊二醛用于提升魚膠原基材料的結(jié)構(gòu)性能。
關(guān)鍵詞：魚膠原;流變性能;熱穩(wěn)定性;化學(xué)交聯(lián)
膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，是動(dòng)物結(jié)締組織的主要纖維蛋白，因其優(yōu)良的生物相容性、生物降解性、低抗原性等性質(zhì)，被廣泛用于化妝品、制藥、食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-3]。
目前，商品化膠原主要取材于牛、豬等陸生哺乳動(dòng)物的皮、腱、骨等結(jié)締組織，但由于瘋牛病、口蹄疫等人畜共患病在世界范圍內(nèi)的頻繁爆發(fā)，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物膠原及其制品存在較大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。因此，尋求能夠完全或部分替代哺乳動(dòng)物膠原的新型膠原材料是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[7-9]。相對(duì)而言，從魚加工廢棄物中提取的魚膠原具有生物安全性好、原料來(lái)源豐富且成本低廉等優(yōu)勢(shì)，因而當(dāng)前圍繞魚膠原的制備、改性及應(yīng)用的研究方興未艾[10-12]。I型膠原是動(dòng)物皮(牛皮、魚皮等)中含量最多的膠原類型[1]。
不論是牛皮還是魚皮，從中提取的I型膠原分子都具有由3條多肽鏈相互纏繞而成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，其分子長(zhǎng)度約為300nm，相對(duì)分子質(zhì)量約為30萬(wàn)[1，10，13]。然而，膠原的氨基酸組成、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)與動(dòng)物的種屬及生存環(huán)境密切相關(guān)。一般而言，陸生哺乳動(dòng)物膠原比魚膠原的熱穩(wěn)定性更好，這主要是由于前者的亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量更高，而亞氨基酸對(duì)于氫鍵的形成及三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定都至關(guān)重要[13，14]。因此，基于魚膠原和牛皮膠原結(jié)構(gòu)與性能的異同，目前已有大量關(guān)于不同來(lái)源魚膠原的研究報(bào)道，但其相關(guān)信息仍然不足以支撐魚膠原的規(guī)模化開發(fā)利用。
其一，魚膠原在制備與應(yīng)用過(guò)程中通常會(huì)涉及膠原溶液的加工處理(如萃取、膠凝、紡絲和成膜)，故充分了解膠原溶液的流變性能非常重要[15-17]，然而鮮見(jiàn)有關(guān)魚膠原溶液的流變學(xué)研究。例如，Zhang等[18]測(cè)試了較高濃度(10~20mg/mL)大鰭鳠魚皮膠原溶液的流變性能，但也有必要了解較低濃度的魚膠原溶液(如膠原提取液)的流變行為及其與牛皮膠原溶液的差異。
其二，魚膠原作為一類蛋白質(zhì)材料，理解其熱穩(wěn)定性及與哺乳動(dòng)物膠原的區(qū)別對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要意義[19-22]，但膠原的熱穩(wěn)定性測(cè)試高度依賴于樣品狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)條件[10，14]，甚至于針對(duì)同一來(lái)源魚膠原的不同文獻(xiàn)報(bào)道的膠原變性溫度數(shù)值存在差異，從而缺乏在相同條件下對(duì)各種膠原材料熱穩(wěn)定性的比較研究。
其三，與哺乳動(dòng)物膠原相比，魚膠原較差的熱穩(wěn)定性與機(jī)械力學(xué)性能限制了其實(shí)際應(yīng)用[11]，進(jìn)而需要通過(guò)交聯(lián)或共混策略強(qiáng)化材料的綜合性能，但關(guān)于魚膠原的改性研究較為少見(jiàn)。例如，已有報(bào)道采用“零長(zhǎng)度”的碳化二亞胺交聯(lián)劑增強(qiáng)鮭魚膠原的熱穩(wěn)定性[11]，然而關(guān)于交聯(lián)劑分子長(zhǎng)度對(duì)魚膠原改性效果的影響尚不清楚。
本文對(duì)比研究了相同濃度(5mg/mL)的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變和熱穩(wěn)定性，并考察了溫度對(duì)黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性以及成纖維性能的影響，最后分析比較了兩種交聯(lián)劑(己二酸-N-羥基 琥珀酰亞胺酯、戊二醛)對(duì)黑魚膠原溶液的交聯(lián)改性效果，為黑魚膠原的高值轉(zhuǎn)化利用提供理論和技術(shù)參考。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1主要材料與儀器
1.1.1主要材料
黑魚魚皮和牛皮I型膠原海綿均為實(shí)驗(yàn)室自制，分別參照文獻(xiàn)方法制備[8，16];冰醋酸、己二酸、戊二醛、丙酮、二甲亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠;高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為電泳級(jí)，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)均為分析純，購(gòu)自上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司;去離子水(自制);其它化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.2主要儀器
3700高速冷凍離心機(jī)，日本KUBOTA公司;FD-1冷凍真空干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DZF-300真空干燥箱，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;pHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;Mini-PROTEAN3CellAssembly電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司;Gemini200動(dòng)態(tài)流變儀，英國(guó)Malven公司;Lambda25紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)PERKIN-ELMER公司;NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀，美國(guó)ThermoScientific公司;DSC200PC差示掃描量熱儀，德國(guó)NETZSCH公司;Agilent400-MRDD2核磁共振波譜儀，美國(guó)AgilentTechnologies公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1膠原溶液的流變測(cè)試
動(dòng)態(tài)頻率掃描：用0.1mol/L醋酸分別配制相同濃度(5mg/mL)的黑魚魚皮膠原和牛皮膠原溶液，在18℃下用動(dòng)態(tài)流變儀檢測(cè)彈性模量G'、粘性模量G''、損耗角正切Tan啄(G''/G')和復(fù)數(shù)粘度濁*隨掃描頻率的變化情況;采用錐形板夾具(錐角4毅、直徑40mm)，應(yīng)變5%，掃描頻率為0.01~10Hz。溫度對(duì)膠原溶液動(dòng)態(tài)粘彈性的影響：用上述動(dòng)態(tài)流變儀對(duì)5mg/mL黑魚膠原溶液進(jìn)行線性升溫并掃描收集流變數(shù)據(jù);固定頻率1Hz，應(yīng)變5%，升溫速率0.5℃/min，掃描溫度區(qū)間18~40℃。
1.2.2差示掃描量熱(DSC)分析
分別以相同濃度(5mg/mL)的黑魚膠原和牛皮膠原溶液為測(cè)試對(duì)象，考察膠原熱變性DSC曲線隨升溫速率的變化規(guī)律。樣品參比為0.1mol/L醋酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)60mL/min，升溫速率采用2、5和8℃/min，溫度區(qū)間4~60℃。
1.2.3熱動(dòng)力學(xué)分析
采用熱動(dòng)力學(xué)分析手段(基于多重升溫速率的等轉(zhuǎn)化率法：Friedman法和OFW法)[21，22]，分別對(duì)1.2.2獲得的兩種膠原的DSC曲線進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，對(duì)比考察不同膠原熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的變化規(guī)律。
1.2.4膠原成纖維濁度曲線測(cè)定
用0.01mol/L醋酸配制5mg/mL黑魚膠原溶液，將其用含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，最終所得膠原溶液的各項(xiàng)參數(shù)分別為：膠原濃度1mg/mL、磷酸鹽濃度10mmol/L、氯化鈉濃度80mmol/L、pH值7.1。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)樣品吸光度變化得到膠原成纖維濁度曲線，掃描波長(zhǎng)為313nm。根據(jù)濁度曲線分別計(jì)算達(dá)到最大吸光度值一半所需時(shí)間(1/2)和達(dá)到平衡時(shí)吸光度的變化值(h)，對(duì)比考察溫度28、29、30、31和32℃對(duì)黑魚膠原成纖維動(dòng)力學(xué)的影響。
1.2.5己二酸NHS酯的合成與表征
在文獻(xiàn)報(bào)道合成方法[23]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整：先用丙酮將己二酸和NHS溶解，然后向混合溶液中加入EDC·HCl，在常溫下攪拌反應(yīng)24h后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，采用結(jié)晶、真空干燥等方法對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到己二酸NHS酯。用核磁共振(NMR)對(duì)樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行1HNMR表征;采用FTIR驗(yàn)證酯基官能團(tuán)，掃描波數(shù)450~4000cm-1，分辨率為2cm-1。
1.2.6黑魚膠原溶液的交聯(lián)改性
酸性條件下的交聯(lián)改性：用0.1mol/L醋酸配制5mg/mL黑魚膠原溶液，用DMSO配制0.125mol/L己二酸NHS酯溶液，將其逐滴加入黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比為1，在18℃下分別反應(yīng)24h和72h后，用甘氨酸中止反應(yīng)并對(duì)0.1mol/L醋酸進(jìn)行透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(a-N1)和SSC(a-N1×3);按照類似方法，采用0.125mol/L戊二醛水溶液，制備得到戊二醛改性黑魚膠原SSC(a-G1)和SSC(a-G1×3)。
堿性條件下的交聯(lián)改性：將0.125mol/L己二酸NHS酯溶液分別逐滴加入四份5mg/mL黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團(tuán)與膠原氨基的摩爾比分別為1/6、1/2、1和1，快速攪拌均勻，再用NaOH調(diào)pH約為10，在18℃下分別反應(yīng)24、24、24和72h后，用甘氨酸中止反應(yīng)，再用0.1mol/L醋酸透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(b-N1/6)、SSC(b-N1/2)、SSC(b-N1)和SSC(b-N1×3);按照類似方法，分別制備得到戊二醛改性魚膠原樣品SSC(b-G1/6)、SSC(b-G1/2)、SSC(b-G1)和SSC(b-G1×3)。
1.2.7交聯(lián)改性黑魚膠原的表征
電泳測(cè)定：參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[12]，將1.2.6所述12種改性魚膠原樣品分別與電泳樣品處理液混合，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)手段考察不同的化學(xué)交聯(lián)改性條件對(duì)黑魚膠原結(jié)構(gòu)的影響，以未改性膠原樣品作為對(duì)照。熱分析：采用DSC對(duì)比考察改性前后黑魚膠原樣品的熱變性情況，升溫速率5℃/min，掃描溫度區(qū)間4~70℃。
2結(jié)果與討論
2.1黑魚膠原溶液的動(dòng)態(tài)流變性能
流變測(cè)試能夠獲得高分子材料在應(yīng)力/應(yīng)變條件下的動(dòng)態(tài)粘彈性信息。展示了相同濃度的黑魚膠原和牛皮膠原溶液的動(dòng)態(tài)粘彈性參數(shù)(G'、G''、Tan啄和濁*)隨頻率的變化規(guī)律。兩種膠原溶液的彈性模量和粘性模量都隨著掃描頻率的增加而升高，而且在相同頻率下(個(gè)別高頻區(qū)除外)黑魚膠原溶液的粘彈性模量均低于牛皮膠原溶液的相應(yīng)模量。
此外，牛皮膠原和黑魚膠原溶液由粘性流動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥粤鲃?dòng)的交叉點(diǎn)頻率分別為0.88Hz和1.51Hz。在交叉點(diǎn)頻率以下，兩種膠原溶液的G'G'')。交叉點(diǎn)頻率與分子鏈段的松弛特性有關(guān)，頻率越大表明松弛越快，可見(jiàn)黑魚膠原比牛皮膠原分子的鏈段松弛更快。相對(duì)而言，兩種膠原溶液的損耗角正切都隨著頻率的增加而降低，且黑魚膠原溶液的Tan啄均大于相同頻率(當(dāng)頻率低于4Hz)下牛皮膠原溶液的Tan啄。
當(dāng)頻率低于0.8Hz時(shí)，Tan啄都大于1，表明此時(shí)兩種膠原溶液都是粘性特征占主導(dǎo)地位，然而牛皮膠原比黑魚膠原的Tan啄小，這可能是由于牛皮膠原分子鏈段纏結(jié)程度更高[16]，鏈段運(yùn)動(dòng)時(shí)的內(nèi)摩擦力更大，從而使鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，表現(xiàn)為彈性特征相對(duì)略強(qiáng)。另外，兩種膠原溶液的復(fù)數(shù)粘度也都隨著頻率增加而降低，呈現(xiàn)剪切變稀流變行為，且在相同頻率下黑魚膠原比牛皮膠原溶液的濁*更小，說(shuō)明黑魚膠原比牛皮膠原分子纏結(jié)程度更低。流變和熱穩(wěn)定性是魚膠原區(qū)別于哺乳動(dòng)物膠原的兩大顯著特征[1]。
在上述動(dòng)態(tài)頻率掃描的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了溫度對(duì)黑魚膠原溶液動(dòng)態(tài)粘彈性的影響當(dāng)溫度低于26℃時(shí)，隨著溫度的上升，G''和濁*逐漸下降而G'和Tan啄變化不大;當(dāng)溫度介于26~32℃，G''和濁*都快速下降，同時(shí)Tan啄出現(xiàn)最大峰值，這是由于溫度誘導(dǎo)膠原構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，即從天然的三股螺旋結(jié)構(gòu)變性為無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象[16-18]。通常把升溫流變測(cè)試時(shí)Tan啄的峰值對(duì)應(yīng)的溫度稱為膠原的動(dòng)態(tài)變性溫度(Tdd)，牛皮膠原、大鰭鳠膠原和黑魚膠原的Tdd分別為32.6℃[16]、29.5℃[18]和29.2℃，表明黑魚膠原的動(dòng)態(tài)流變穩(wěn)定性與大鰭鳠膠原相當(dāng)，但二者都低于牛皮膠原。
2.2黑魚膠原溶液的熱穩(wěn)定性分析
本文從以下3個(gè)方面研究考察了黑魚膠原溶液的熱穩(wěn)定性：1)比較相同濃度黑魚膠原和牛皮膠原溶液在多個(gè)升溫速率下的DSC曲線;2)基于等轉(zhuǎn)化率法動(dòng)力學(xué)分析，從活化能角度對(duì)比兩種膠原溶液的熱行為;3)考察不同溫度對(duì)黑魚膠原成纖維過(guò)程的影響。兩種膠原溶液的DSC吸熱峰都隨著升溫速率的增加而向高溫方向移動(dòng)，說(shuō)明二 者的熱變性都是動(dòng)力學(xué)控制過(guò)程[21，22]。
在相同升溫速率下，黑魚膠原的熱變性DSC峰值溫度明顯低于牛皮膠原的相應(yīng)數(shù)值，分別為2℃/min：31.1℃和39.3℃;5℃/min：32.3℃和40.4℃;8℃/min：32.9℃和40.9℃，說(shuō)明黑魚膠原的熱穩(wěn)定性相對(duì)牛皮膠原較弱。為了進(jìn)一步挖掘其中DSC曲線的熱動(dòng)力學(xué)信息，采用等轉(zhuǎn)化率法(Friedman法和OFW法)考察了膠原熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的變化規(guī)律。
盡管兩種等轉(zhuǎn)化率法對(duì)于同一膠原樣品的分析結(jié)果存在一定差異，但黑魚膠原和牛皮膠原的熱變性活化能隨轉(zhuǎn)化率的增加都是整體呈下降趨勢(shì)，且近似于先凹后凸，這說(shuō)明兩種膠原的熱變性過(guò)程都為多步復(fù)雜反應(yīng)[21,22]。特別需要強(qiáng)調(diào)的是，在熱變性的初始階段(轉(zhuǎn)化率小于0.5)，相同轉(zhuǎn)化率下黑魚膠原的熱變性活化能低于牛皮膠原的活化能，表明黑魚膠原的熱穩(wěn)定性略差。膠原在模擬生理?xiàng)l件下的自組裝成纖維性質(zhì)對(duì)于其高值應(yīng)用十分重要[1]。
隨著溫度的升高，黑魚膠原成纖維的速度加快(1/2逐漸下降)，同時(shí)成纖維濁度的最大值呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)(△在30℃時(shí)達(dá)到峰值)，這是由于膠原成纖維的主要驅(qū)動(dòng)力是疏水作用，而升溫有利于增強(qiáng)疏水作用[24]，從而促使膠原成纖維進(jìn)行，但當(dāng)溫度臨近膠原的熱變性溫度時(shí)，膠原分子結(jié)構(gòu)遭受破壞，進(jìn)而阻礙了自組裝膠原纖維的形成。可見(jiàn)，30℃是適于黑魚膠原成纖維的較優(yōu)溫度條件，但該溫度明顯低于人體的正常生理溫度。若想將黑魚膠原在人體內(nèi)進(jìn)行原位自組裝成纖維的應(yīng)用，有必要通過(guò)改性手段提高其在生理環(huán)境下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
2.3黑魚膠原溶液的化學(xué)交聯(lián)改性
綜合2.1和2.2所述可知，黑魚膠原的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性比牛皮膠原差，在一定程度上限制了黑魚膠原的應(yīng)用，因而有必要通過(guò)化學(xué)交聯(lián)等手段改性提升膠原材料的穩(wěn)定性[10，11]。據(jù)報(bào)道，交聯(lián)劑的分子長(zhǎng)度對(duì)于有效穩(wěn)固膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)非常關(guān)鍵[25]，因而本文對(duì)比考察了兩種分子碳鏈長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑對(duì)黑魚膠原的改性效果：1)戊二醛，傳統(tǒng)的膠原交聯(lián)劑，反應(yīng)活性高，但生物相容性較差[1,26];2)己二酸NHS酯，近年來(lái)新興的蛋白偶聯(lián)劑，反應(yīng)活性和生物相容性都較好[1,14]。
3結(jié)論
相同濃度的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變行為和熱穩(wěn)定性存在較大差別，黑魚膠原的分子纏結(jié)程度更低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更差。在確保膠原不變性的前提下，通過(guò)改變溫度能夠有效調(diào)節(jié)黑魚膠原的動(dòng)態(tài)粘彈性與成纖維性能。盡管己二酸NHS酯的反應(yīng)活性比戊二醛弱，但其更好的生物相容性以及足夠高的交聯(lián)改性程度，使其有望用于提升膠原材料的綜合性能，以此推動(dòng)魚膠原基生物材料的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)：
[1]李國(guó)英，劉文濤.膠原化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2013.
[2]胡利媛，梁玉可，王春華，等.PEG擁擠環(huán)境對(duì)膠原蛋白構(gòu)象的影響研究[J].皮革科學(xué)與工程，2020，30(1)：1-6.
[3]ShiC,BiC,DingM,XieJ,etal.Polymorphismandstabilityofnanostructuresofthreetypesofcollagensfrombovineflexortendon,rattail,andtilapiaskin[J].FoodHydrocolloids,2019,93:253-260.
[4]JinS,SunF,ZouQ,etal.Fishcollagenandhydroxyapatitereinforcedpoly(lactide-co-glycolide)fibrousmembraneforguidedboneregeneration[J].Biomacromolecules,2019,20:2058-2067.
[5]FelicianF,XiaC,QiW,etal.CollagenfromMarineBiologicalSourcesandMedicalApplications[J].Chemistry&Biodiversity,2018,15:e1700557.
[6]AnaLA,AnaLP,TiagoH,etal.CosmeticPotentialofMarineFishSkinCollagen[J].Cosmetics,2017,4(4):39-55.
[7]LiuW,LiG,MiaoY,etal.Preparationandcharacterizationofpepsin-solubilizedtypeIcollagenfromthescalesofsnakehead(Ophiocephalusargus)[J].JournalofFoodBiochemistry,2009,33:20-37.
作者：劉文濤1，2*，白聰1，3，沈里瑞1
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